91猫先生

研究过程的提问-以抗血栓药物研发為例
　

生化生醫所 蔡少偉教授

在老师指导学生进行研究过程中，总是随时耳提面命，要求学生必须先培养提问的能力，亦即不管是阅读他人的论文或是检视自我的实验数据时，必须先心存质疑的态度，然后透过思虑与提问，以及提出可能的解答。即使暂时无解决之道，只要这些问题如影随形盘旋在脑海中，自然就会随时产生联想，最后可能豁然开朗获得解答，成為研究过程中的小确幸。

過去數年本人實驗室嘗試利用具立體選擇性絲胺酸型水解酶（包含酯解酶、脂肪分解酶、絲胺酸型蛋白質分解酶），開發前對掌性異構物 (prochiral compounds) 之去對稱化 (desymmetrization) 或外消旋物 (racemates) 的動力分割 (kinetic resolution) 製程。在目標產品以及擬進行催化基質的官能基確定後，就會依據酵素工程 (enzyme engineering) 包括酵素來源篩選、前處理与固定化、其來源基因之定點突變、多點突變、或定向演化等、介質工程 (medium engineering) 包括影響反應之環境因素，如：溫度、溶劑、pH 值、抑制劑等、以及基質工程 (substrate engineering) 包括各種基質衍生物等三個方向思考可能使用的變因，以期能夠提高酵素表現（即選擇性、反應性、与穩定性）。可惜的是，到目前為止尚無一套有效的策略能夠定量（甚或只有定性）預測酵素行為；因此初步的酵素來源、反應條件与基質型態的篩選乃屬必要。此外，酵素的催化原理与相關有機化學反應的基本知識，仍然是不能輕易忽略的，因為它們可能就是提供解答的關鍵。

就以抗血小板凝集劑 Clopedogrel 的前驱物 (R)-2-chloromandelate  為例，进行其外消旋基质的酯解酶水解动力分割（如图一），在初步篩選酵素來源 (K. oxytoca esterase  )、兩相反應系統（異辛烷：水 = 6:1  v/v）、反應溫度  (55^oC)  後，應用基質工程的概念以不同離去能力醇基的酯類衍生物為基質，由動力學分析獲得圖二的結果。圖中 k_2R/K_mR、k_2S/K_mS  与 E= (k_2S/K_mS)/(k_2R/K_mR) 分別代表 (R)- 型基質、(S)- 型基質的反應性、以及酵素立體選擇性。離去基 R₂ 基团的诱导参数越大代表其愈容易水解离去，所以&苍产蝉辫;(搁)-  型与 (S)- 型基質的反應性皆能提升，且 E >1  並隨之增加。但是當诱导参数超過 0.03 時，反應快的 (S)- 型基質的反應速率增加幅度卻較  (R)-  型基質慢，致使立體選擇性 E 下降而得到最大值。

                有了這些結果後，接下來的提問就是：

一、為何酵素有与非酵素觸媒（如 OH^-  ）类似之催化行為？能否从酵素催化机构来说明此现象？

二、能否找到更适合的离去基，使得诱导参数增加时，反应快的(厂)-型基质的反应速率的增加幅度不会慢下来，因此酵素的立体选择性也能够随之提高？

叁、上述的结果能否扩展至其他丝胺酸型水解酶？

這些問題是否能夠獲得解答，甚至進而開發具有產業競爭力的酵素製程？當然一切要仰賴持續不斷的嘗試与努力，再加上一點上天的恩寵了。（持續閱讀 Adv. Syn. Cat., 351, 2333-2341, 2009）