91猫先生

奈升级线上多维液相层析质谱技术於蛋白质体分析之应用

生化科 簡昆鎰助理教授

近年来蛋白质体学已经被广泛的应用在肿瘤生物标帜的找寻及其他基础生物医学领域研究。蛋白质体学之所以能够蓬勃发展，其中最重要的关键在於质谱仪设备的快速升级，以质谱仪分析取代传统的艾德曼胜肽胺基酸定序 ( Edman sequencing )，使得蛋白质鑑定的效能广泛的提升，进而使整体蛋白质体的分析得以进行。以液相层析质谱学為根基的鸟枪式 ( shotgun ) 胜肽鑑定技術，是目前蛋白質體分析的主流。運用優異的胜肽分離系統搭配掃瞄速度快的質譜儀，數萬條胜肽對應數千個蛋白質可在幾個小時內鑑定完成。有趣的是，儘管利用同樣的質譜儀分析類似的樣品，不同的實驗室之蛋白質體鑑定的成果相差卻是十分懸 殊。其中的一個重要原因即是對液相層析系統的運用及胜肽特質的掌握能力不同所致。惟有提高胜肽的回收率及分離效能，才能獲得最佳的分析成果。

受限於蛋白质样品的总量，尤其是临床样品，现今的液相层析均採用低流量奈升级 ( nano liter scale ) 的系统，以提高灵敏度。当流量减低至奈升级时，进样速度及接管之间的多餘体积，均会影响数据取得的时间及分离效能。因此研究者通常会使用微小的捕捉管柱 ( trap column )，使样品能以较高的流速进样，并停留在捕捉管柱中，再透过多孔阀的切换，将之与逆相 ( reverse phase ) 层析分析管柱连结，进而大幅提高样品分析的速度，并保有管柱的分离能力。由於质谱仪运作时，是採用巧妙的讯息导向之数据取得方式 ( information dependent data acquisition，IDA )，讯号强 ( 含量较高 ) 的胜肽分子将优先进行分析，如果胜肽分离效能不彰，微量分子与高含量分子同时析出，则微量分子被鑑定到的机会就会大幅降低。

针对高复杂度样品，二维液相层析是最常為人採用的策略。其作法是利用不同分离原理 ( 例如：离子交换法 ) 将样品进行第一维的分离，将所得的 30-60 个组份 ( fraction )，个别以第二维液相层析串联质谱仪进行分析，如此整体的分离效能可以提高数十倍。本实验室主要的工作在於建立高效能的线上多维胜肽分离系统，以提高样品的回收率，进而提昇质谱鑑定能力。由於上述二维液相层析中不同维度分离所使用的冲提液系统不尽相容，因此我们设计了一套线上稀释的装置，将第一维管柱析出之溶液，以水 ( 与第二维逆相层析法相容 ) 进行高倍率稀释，再导入捕捉管柱进行样品净化的工作 ( 除盐 )。為使分离工作不需间断，十孔阀装置 2 支捕捉管柱，其中一支进行捕捉的同时，另一支则串联至分析管柱进行质谱分析。当每次第一维分离组份完成时，十孔阀即进行切换，使捕捉管柱的角色互换，如此即可达到最高的时间利用效率 ( 如图一 )。

此系统建构完成后，几乎任何分离方法皆可搭配成二维分离系统。目前我们已经测试了以阳离子交换法、阴离子交换法以及硷性逆相层析法做為第一维分离策略，皆可顺利地与第二维酸性逆相层析法搭配。利用这样的系统我们可以从 250 ng 的细胞萃取蛋白样品中鑑定到 2249 个蛋白质，其中 1604 个蛋白质至少鑑定到 2 段胜肽。除了针对微量样品，我们也可依据蛋白进样量调整第一维分离之组份数及总分析时间，以达到最高的蛋白鑑定效能。

未来我们期许此系统搭配高感度质谱仪分析，能够像 DNA 微阵列技术一样，发展出「胜肽液相层析微阵列」的技术，使蛋白质体学分析的宏观度、灵敏度及可信度均更上一层楼。