91猫先生

BD FACSAriaIIu, 4-laser, 9 colour 

488nm Blue Laser		?
Alexa Flouor 488, FITC, BB515	530/30	502LP
PE	575/26	556LP
PE-Texas Red	610/20	595LP
PI, PerCP, PerCP-Cy5.5, BB700	695/40	655LP
PE-Cy7	780/60	735LP
633nm Red Laser	?	?
APC, Alexa Fluor 647	660/20	N/A
APC-Cy7, APC-H7	780/60	735LP
375nm Near UV Laser (choose one)	?	?
DAPI/Hoechst Blue (Cell cycle)	450/40	N/A
Hoechst Red (Side population)	670LP	610LP
405nm Violet Laser (choose one)	?	?
Alexa Fluor 405, V450, BV421, Pacific Blue	450/40	N/A
Alexa Flouor 430, AmCyan, V500, BV510	510/50	502LP

&苍产蝉辫;相关配备

 (1)  噴嘴 (Nozzle) :  70, 85 and 100 um

 (2)  收集管 (Collection devices) :

         兩向分選、四向分選: 5mL Falcon tubes or 15 mL tubes

         盤式分選: 6-, 12-, 24-, 48- and 96-well plate

(3) 上樣管 (Sample tube) : 5mL Falcon tubes or 15 mL tubes  

1. 檢體置備之注意事項

(a) 建議樣本濃度

Nozzle	Cell type	Concentration
70 μm	Lymphocytes, thymocytes or splenocytes (直徑8-12μm)	8~12 x 106/ml
85 μm	Activated lymphocytes, small cell lines (直徑12-20μm)	7~9 x 106/ml
100 μm	Large adherent cell line (直徑>20μm)	5~8 x 106/ml

               

(b) 檢體上樣前過篩

檢體上樣前，為了降低阻塞物的可能，細胞樣本在分選之前需要用40 μm的篩網過濾(BD Cat. No. 352340) 或含篩網蓋試管(BD Cat. No. 352235)，過濾後細胞應是繼續避光冰浴保存。容易黏附的細胞，則有必要考慮在即將分選前再進行篩網過濾，因為冰存時間一長，細胞可能再度聚集。

Q&A

Q1. 上样之检体应置配在何种缓衝液裡? 可以直接悬浮在培养液裡吗?

Ans. 不建議將細胞懸浮於medium中，因為medium中的 Phenol Red 會干擾螢光訊號，影響分選的結果，請於上機前將細胞懸浮於樣品緩衝液中。

§&苍产蝉辫;建议的基础配方：

1x Phosphate Buffered Saline (不含鈣、鎂離子)

1mM EDTA

25mM HEPES pH 7.0?

1% Fetal Bovine Serum (Heat-Inactivated)

0.2um filter sterilize, store at 4℃

§&苍产蝉辫;淋巴系细胞样本缓衝液配方：

1x HBSS with 1% FBS

贬叠厂厂配方中的阳离子可增进细胞的生存力。由於这些细胞并非易於丛集细胞，配方中缺乏贰顿罢础不成问题。

§&苍产蝉辫;為黏附细胞设计的配方：

Raise the concentration of the EDTA to 5mM and use FBS that has been dialyzed against Ca/Mg++ free PBS。EDTA可抑制細胞黏附。

§&苍产蝉辫;為贴壁型细胞株设计的配方：

為了完成單細胞懸浮液的準備，必須從detach步驟就開始注意。一般先以 PBS 潤洗，再以Trypsin處理以釋放細胞，待細胞變圓(切記不可過度作用)，便以 5 ml 含5%血清培養液收取細胞，並均勻地打散細胞懸浮液。調整細胞濃度，並換成基礎樣本緩衝液配方。

§&苍产蝉辫;為含有高比例死细胞的样本：

基礎配方加5mM MgCl2加25~50 ug/mL DNAase I (Sigma D-4513)。這緩衝液配方將幫助減少因DNA造成的細胞聚集。

这些建议将有助於在处理样本时，提高整个细胞族群生存能力，并在后续分选程序中提昇标靶细胞的回收率。

Q2. 分选收集管裡面需要置放buffer吗?

Ans: 分選收集管可以事先加以coating, 提高細胞存活率 (1% BSA或 10% FBS, 4℃, overnight) 。

§ 以 15mL 離心管收集細胞時, 一般建議先於管內加入 7~8mL 收集液 (medium, PBS或其他溶液)。

§ 以 5mL Falcon tube 收集細胞時, 一般建議先於管內加入 2~3mL 收集液。

Q3. 如果分選出來的樣品要在培養，會汙染吗?

Ans: 儀器在開關機時會進行清洗，但因為儀器所處環境仍非無菌，故通常建議帶來要接收分選產物的Meduim要加入抗生素，以減低污染之機率。

   Data

The BD FACSAriaII system was set up for a sort using either a 70-μm or 100-μm nozzle (70 psi or 35 psi with a frequency of 87 or 60 kHz respectively). CD45RA+ Tregs and CD45RA- Tregs were sorted in purity mode at a rate of 10,000 to 11,000 events per second.

Human HT-29 colon cancer cells were stained with Hoechst 33342 and acquired on the BD FACSAriaIII equipped with a 375-nm laser (left dot plot). As a control, side population expression was blocked (right dot plot).